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«Maximilian Wilhelm Casteel Aus dem Department für Veterinärwissenschaften der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Unversität München ...»

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Bedeutung von DUSP1 und Expression MAPKinasen-spezifischer

Transkriptionsfaktoren während der zellulären Antwort auf

Deoxynivalenol

Maximilian Wilhelm Casteel

Aus dem Department für Veterinärwissenschaften

der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Unversität München

Arbeit angefertigt unter der Leitung von

-Univ.-Prof. Dr. Dr. h. c. E. MärtlbauerBedeutung von DUSP1 und Expression MAPKinasen-spezifischer

Transkriptionsfaktoren während der zellulären Antwort auf Deoxynivalenol Inaugural-Dissertation zur Erlangung der tiermedizinischen Doktorwürde der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München von Maximilian Wilhelm Casteel aus Aachen München 2011 Gedruckt mit der Genehmigung der Tierärztlichen Fakultät der Ludwig-Maximilians-Universität München Dekan: Univ.-Prof. Dr. Braun Berichterstatter: Univ.-Prof. Dr. Dr. h. c. Märtlbauer Korreferent/en: Priv.-Doz. Dr. Breuer Univ.-Prof. Dr. Kaspers Univ.-Prof. Dr. Matiasek Univ.-Prof. Dr. Zerbe Tag der Promotion: 12. Februar 2011 Für Resi und Nene Inhaltsverzeichnis Einleitung Schrifttum 2.1 Allgemeines 3 2.2 Bildung von DON 3 2.3 Physikalisch-chemische Eigenschaften 4 2.4 Biologische Eigenschaften von DON 4 2.4.1 Toxikokinetik von DON 7 2.5 Zelluläre Wirkungsmechanismen von DON 8 2.5.1 Einfluss von DON auf die Proteinsynthese 8 2.5.2 Einfluss von DON auf die Mitogen-aktivierten Proteinkinase 10 Signaltransduktionswege 2.5.2.1 Einfluss von DON auf die Expression/Aktivierung von MAPKs- 13 spezifischen Transkriptionsfaktoren 2.5.2.2 Einfluss von DON auf die Induktion negativer Regulatoren der MAPK- 14 Signaltransduktionswege 2.5.3 Apoptotisches Potential von DON 17 Publikationen 3.1 Induction of MAPK-dependent transcription factors 21 by deoxynivalenol in human cell lines 3.2 Impac

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ATF3 Activating transcription factor 3 CREB cAMP responsive element-binding protein CXCL-8 CXC chemokine ligand 8 DOM-1 De-epoxy-deoxynivalenol

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DUSP1 Dual specificity phosphatase 1 EGR-1 Early growth response protein 1 ERK Extracellular signal regulated kinase FOS FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog FOSL2 Fos-like antigen 2 GTPase Guanidine triphosphatase HCK Hemopoietic cellular kinase HSP27 Heat shock protein 27 IGF Insulin-like growth factor IGFALS Insulin-like growth factor acid-labile subunit iNOS Inducible nitric oxide synthase JNK C-Jun N-terminal kinase JUN Jun avian sarcoma virus 17 oncogene homolog

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MAPKAPK2 (MK2) Mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2 MEK1/2 Mitogen-activated protein kinase kinase 1/2 MKP-1 Mitogen-activated protein kinase phosphatase 1

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Deoxynivalenol (DON) ist das weltweit am häufigsten nachgewiesene Mykotoxin in Nahrungs- und Futtermitteln (Canady et al. 2001). Es gehört zu den Typ B Trichothecenen, die während des Sekundärstoffwechsels einer Reihe von pflanzenpathogenen Pilzen gebildet werden. Die größte Bedeutung spielt hierbei die Gattung Fusarium, in Europa vornehmlich F. culmorum und F. graminearum, die während der Blüte, begünstigt durch feucht-warmes Wetter, Getreidepflanzen befallen und hohe Mengen an DON produzieren können (Rocha et al. 2005). In den letzten Jahren konnte eine steigende Inzidenz der partiellen Taubährigkeit beim Weizen und der Kolbenfäule beim Mais beobachtet werden (Marchand et al. 2008).

Verantwortlich hierfür scheinen sowohl klimatische als auch veränderte agrarwirtschaftliche Anbauverfahren zu sein (Paterson und Lima 2009; Hope et al. 2005). Dies führt neben den hierbei entstehenden wirtschaftlichen Verlusten auch zu einer zunehmenden Toxinbelastung von getreidehaltigen Lebensmitteln und somit zu einer verstärkten chronischen Exposition des Verbrauchers (Pestka 2010).

Berichte über akut verlaufende Vergiftungen beim Menschen hervorgerufen durch die Aufnahme DON belasteter Lebensmittel stammen überwiegend aus Asien. Unter den heutigen Lebensbedingungen können akute Intoxikationen in industrialisierten Staaten jedoch ausgeschlossen werden. Bei DON handelt es sich um ein chemisch-physikalisch sehr stabiles Molekül, das während der Verarbeitung von Getreide, sowie bei der Lebensmittelherstellung nicht zerstört wird. Somit ist das Risiko einer chronischen Exposition des Menschen auf geringem Konzentrationsniveau sehr hoch (Hazel und Patel 2004). Um den Verbraucher zu schützen, wurden innerhalb der EU Höchstmengenregelungen für DON in Getreide verabschiedet. Die derzeitigen Höchstmengen in getreidehaltigen Lebensmitteln liegen zwischen 1250 und 1750 µg DON/kg (Verordnung 1126/2007).

In vivo Studien an Tieren konnten zeigen, dass die chronische Aufnahme DONkontaminierten Futters vor allem zu Störungen des Immunsystems und Wachstumsdepression führt (Dänicke et al. 2004; Pestka und Amuzie 2008). Auf molekularer Ebene konnte mittels in vitro Studien sowohl eine Proteinsynthese-hemmende Wirkung als auch eine Aktivierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs) nachgewiesen werden (Ehrlich und Daigle 1987; Shifrin und Anderson 1999). Die MAPKs nehmen über die Aktivierung spezifischer Transkriptionsfaktoren Einfluss auf die Regulation der Proliferation, Differenzierung,

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Migration, Apoptose, sowie Chemokin- und Zytokinsynthese und sind somit ein essentieller Bestandteil der stimulusspezifischen Zellantwort (Johnson und Lapadat 2002).





Um die Bedeutung der MAPK-Pathways in der zellulären Antwort auf DON zukünftig besser einschätzen zu können, ist es von entscheidender Bedeutung, sowohl die Rolle der MAPKsspezifischen Transkriptionsfaktoren als auch die Rolle negativer Regulatoren der MAPKPathways näher zu beleuchten. Bislang sind nur wenige Daten über die Expression MAPKsspezifischer Transkriptionsfaktoren unter DON-Exposition verfügbar (Nielsen et al. 2009).

Dabei sind letztlich diese Faktoren verantwortlich dafür, dass transiente Signale der Zellmembran in langfristige Änderungen der Genexpression umgesetzt werden (Barnes 2006) und stellen somit wichtige Faktoren in der adäquaten Zellantwort dar. Durch die Transkriptionsfaktoren wird auch die Expression negativer Regulatoren der MAPK-Pathways eingeleitet und somit ein Überschießen der zellulären Antwort auf externe Stimuli verhindert.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, zum einen die DON-induzierte Expression von MAPKs-abhängigen Transkriptionsfaktoren in verschiedenen humanen Zelllinien unterschiedlicher geweblicher Herkunft detaillierter zu untersuchen und zum anderen zu überprüfen, welche Rolle negative Regulatoren des MAPK-Pathways, insbesondere Dualspezifische Phosphatasen, bei der zellulären Antwort auf eine DON-Exposition spielen.

Die Arbeit wurde im Rahmen des Graduiertenkollegs „Funktionale Genomforschung in der Tiermedizin“ (GRK1029) durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert.

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2.1 Allgemeines Deoxynivalenol (DON) ist das weltweit am häufigsten nachgewiesene Mykotoxin in Nahrungs- und Futtermitteln. Um hieraus resultierende Risiken für den Verbraucher besser einschätzen zu können, besteht seit der erstmaligen Isolierung von DON Anfang der siebziger Jahre ein großes Interesse an der Aufklärung seiner biologischen und physikalischchemischen Eigenschaften. Trotz umfangreicher Gutachten und Risikobewertungen durch nationale und internationale Gremien wie das gemeinsame FAO/WHO Expertenkomitee (JOINT FAO/WHO EXPERT COMMITTEE ON FOOD ADITIVES; JECFA, 2001) oder dem SCF (SCIENTIFIC COMMITTEE ON FOOD; 1999 und 2003) sind zahlreiche biologische Eigenschaften, insbesondere Details zum Wirkungsmechanismus auf zellulärer Ebene bislang ungeklärt.

2.2 Bildung von DON

DON wird in Europa von potenten pflanzenpathogenen Fusarien, insbesondere Fusarium graminearum und Fusarium culmorum, gebildet, die während der Blüte begünstigt durch Niederschläge vorwiegend Weizen und Mais befallen (Hope et al. 2005; Lacey et al. 1999).

Neben ihrer Fähigkeit hohe Konzentrationen von Toxinen zu produzieren und der daraus resultierenden Gefahr für den Verbraucher, führen sie zu großen wirtschaftlichen Verlusten in der Agrarwirtschaft als Verursacher der partiellen Taubährigkeit beim Weizen und der Kolbenfäule beim Mais. Aufgrund seiner Anpassung an kühle bis gemäßigte Klimazonen war F. culmorum lange Zeit die dominierende Fusarium-Spezies in Mittel- und Nordeuropa. Die klimatischen Veränderungen der letzten Jahre mit zunehmend feucht-warmen FrühsommerMonaten führten jedoch zu einer rasanten Ausbreitung von F. graminearum, dessen Vorkommen lange Zeit auf den südlichen Teil Europas beschränkt war (Xu und Berrie 2005;

Xu et al. 2008). Ein weiterer wichtiger Faktor für die rasche Ausbreitung von F. graminearum ist die hohe Empfänglichkeit der in Mitteleuropa angebauten Weizen-Kultivaren und MaisHybriden. So können in Abhängigkeit von den klimatischen Bedingungen Konzentrationen von mehr als 5 mg/kg DON in Weizen und Mais nachgewiesen werden. Aufgrund der Tatsache, dass es sich bei DON um ein chemisch-physikalisch sehr stabiles Molekül handelt, welches während Lagerung, Mahlprozessen, Erhitzen und weiteren Produktionsschritten von

-3Schrifttum Lebens- und Futtermitteln nicht zerstört wird (Hazel und Patel 2004), scheint die Entwicklung von resistenten Weizen-Kultivaren und Mais-Hybriden gegen F. graminearum und F. culmorum ein entscheidender Schlüssel für die Reduktion von DON in getreidehaltigen Lebens- und Futtermitteln zu sein (Schmolke et al. 2005).

2.3 Physikalisch-chemische Eigenschaften

DON (3α,7α,15-trihydroxy-12,13-epoxytrichothec-9-en-8-on) ist ein chemisch und physikalisch stabiles Molekül, welches während der verschiedenen Produktionsschritte von Lebens- und Futtermitteln nicht zerstört wird (Bretz et al. 2006; Hazel und Patel 2004). Es gehört zu den Trichothecenen, einer großen Gruppe von Mykotoxinen, die eine gemeinsame 12,13-Spiroepoxy-Sesquiterpenoid-Grundstruktur (Abb. 1) aufweisen. Die Epoxidgruppe ist verantwortlich für die biologische Wirksamkeit der Verbindung, insbesondere für die Proteinsynthese-hemmende Wirkung (Pestka 2008). Aufgrund unterschiedlicher Substituenten lassen sich die bisher isolierten 180 Trichothecene in vier Gruppen einteilen (Typ A-D). DON zählt aufgrund seiner Carbonylgruppe an C8 zu den Typ B Trichothecenen.

Weiterhin lassen sich zu dieser Gruppe seine biosynthetischen Vorstufen 3- bzw. 15AcetylDON, sowie Nivalenol und Fusarenon X zählen. Einen Überblick über die Strukturformel wichtiger Typ B Trichthecene, sowie die physikalisch-chemischen Eigenschaften von DON gibt Abb. 1.

2.4 Biologische Eigenschaften von DON

DON konnte erstmalig 1972 von japanischen Wissenschaftlern aus Getreide im Zusammenhang mit einer Lebensmittelintoxikation beim Menschen isoliert werden (Morooka et al. 1972). Kurze Zeit später wiesen amerikanische Wissenschaftler ein von seiner Struktur her identisches Toxin in mit F. graminearum kontaminiertem Mais nach, das bei Schweinen starkes Erbrechen ausgelöst hatte und gaben ihm den Namen Vomitoxin (Vesonder et al.

1973). Der Name Vomitoxin findet bis heute als Trivialbezeichnung für DON Verwendung.

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Abbildung 1: Strukturformel wichtiger Typ B Trichothecene, sowie physikalisch-chemische Eigenschaften von DON In den folgenden Jahren wurden regelmäßig Lebensmittelintoxikationen beschrieben, für die DON verantwortlich gemacht wurde. Einer der größten Ausbrüche fand 1991 in China statt.

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Von Juni bis Oktober erkrankten insgesammt 130 000 Menschen nach der Aufnahme von verdorbenem Mais, Weizen und Gerste. Als Leitsymptome wurden Abdominalschmerz, Nausea, Vomitus, Apathie und Fieber beschrieben. Eine anschließende Untersuchung des verdorbenen Getreides ergab eine hohe Belastung mit DON. Die höchsten Konzentrationen wurden im Mais (Mittelwert 10728 µg/kg, Maximalwert 21200 µg/kg) gefolgt von Weizen (Mittelwert 7044 µg/kg, Maximalwert 51450 µg/kg) und Gerste (Mittelwert 1827 µg/kg, Maximalwert 3521 µg/kg) gefunden. Neben DON konnten zwei weitere Fusarien-Toxine (Zearalenon und Fumonisin) nachgewiesen werden, jedoch in weitaus geringeren Konzentrationen (Li et al. 1999). Zudem konnten bei einem Ausbruch in Indien weitere Symptome wie Schlundirritationen und blutiger Stuhl beobachtet werden. Auch hier wurden im belasteten Weizen weitere Fusarien-Toxine, wiederum in wesentlich geringeren Konzentrationen, identifiziert (Bhat et al. 1989; Miller 2008). Den bisher beschriebenen Ausbrüchen ging immer ein verregneter Frühsommer voraus, wodurch das Wachstum Trichothecen-bildender Fusarien stark begünstigt wurde. Fraglich bleibt, inwieweit DON allein für die beschriebenen Symptomatiken verantwortlich gemacht werden kann.

Synergistische Wechselwirkungen sind aufgrund der Tatsache, dass Fusarien verschiedene Toxine gleichzeitig produzieren können, nicht auszuschließen. Bis heute sind wenige Studien bekannt, die Kombinationen von häufig gemeinsam auftretenden Mykotoxinen auf den Organismus untersuchten (Speijers und Speijers 2004). Um diese Frage klären zu können, müssen zunächst die Toxizitätsmechanismen der Einzeltoxine genauer erforscht werden, damit zukünftig sinnvolle Rückschlüsse auf synergistische Wechselwirkungen getroffen werden können. Allerdings veröffentlichte das SCF im Jahre 2002 ein Gutachten, das einen Synergismus von Einzeltoxinen als unwahrscheinlich einstufte, dabei wurde jedoch auch die limitierte Datenlage bemängelt.

Akut verlaufende Intoxikationen, die hohe Konzentrationen von DON erfordern, treten beim Menschen unter den heutigen Lebensbedingungen in industrialisierten Staaten nicht mehr auf.

Eine umfangreiche Studie (SCOOP 2003) kam jedoch zu dem Ergebnis, dass in Abhängigkeit von vielen Faktoren – wie z.B. Verzehrsgewohnheiten, geographische Herkunft – in der europäischen Bevölkerung der TDI von 1 µg/kg KGW bei Erwachsenen um bis zu 46,1 % und bei Kindern um bis zu 95,9 % überschritten wird.

Die in zahlreichen Fütterungs- und anderen Tierversuchen erhobenen Daten zur Toxizität der Trichothecene sind in den bereits erwähnten Monographien des SCF (1999, 2002) und des

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